شناسایی و تعیین مقاومت به آنتی بیوتیک erwinia amylovora، عامل بیماری آتشک گلابی درختان میوه دانه دار در استان اصفهان

آتشک گلابی (fire blight) یکی از بیماری های بسیار مهّم درختان میوه دانه دار محسوب می شود که توسط باکتری erwinia amylovora روی میزبان های مختلف خانواده گلسرخیان ایجاد می شود. علائم بیماری آتشک درختان میوه دانه-دار معمولاً اوایل بهار در گل ها ظاهر می شود. گل ها علائم آب سوختگی (water soaking) نشان داده و بعد از تغییر رنگ به قهوه ای، پژمرده شده و ریزش می کنند. علائم بیماری سپس روی برگ ها به صورت لکه های سیاه در طول رگبرگ اصلی و رگبرگ جانبی دیده می شود. چنانچه روی شاخه های آلوده میوه ای تشکیل شود، در ابتدای رشد، میوه چروکیده شده و در نهایت سیاه می شود که در مواردی با ترشح باکتری (ooze) همراه است. طی سال های گذشته شیوع بیماری آتشک در درختان میوه دانه دار در مناطق مختلف کشور، خسارت قابل توجهی را به باغداران تحمیل کرده است. اخیراً نیز، مشاهده اولیّه درختان سیب مبتلا به آتشک در ناحیه شاهین شهر و میمه و سپس وقوع این بیماری در درختان گلابی، سیب و به منطقه نطنز، معلوم نمود که استان اصفهان نیز از خسارت بیماری مصون نیست و آتشک درختان میوه دانه دار در حال گسترش در باغات این منطقه می باشد. طی این پژوهش، بر اساس مشخصات مرفولوژیکی، بیماری زایی، بیوشیمیایی و ژنتیکی، عامل بیماری آتشک درختان میوه دانه دار e. amylovora شناسایی شد. بررسی های انجام شده مشخص نمود که جدایه های مورد مطالعه به لحاظ خصوصیات بیماری زایی و بیوشیمیایی مشابه یکدیگر بوده و خصوصیات آنها با مشخصات جدایه های e. amylovora گزارش شده در منابع علمی مطابقت دارد. در بررسی های ملکولی، طی واکنش pcrبا استفاده از جفت آغازگراختصاصی b/eaa یک قطعه bp 187 در کلیه جدایه ها تکثیر شد. جفت آغازگر pea29a/b نیز قادر به تکثیر یک باند dna kb 9/0 در جدایه ها بود که توالی نوکلئوتیدی آن 99% با جدایه های گزارش شده e. amylovora از سایر مناطق دنیا شباهت داشت. بررسی تنوع ژنتیکی جدایه ها به روش rep-pcrبا استفاده از آغازگرهای box و eric نشان داد که جدایه های عامل بیماری آتشک در استان اصفهان با جدایه های سایر مناطق کشور اختلاف قابل توجهی ندارد. به دلیل اینکه در کنترل بیماری آتشک از آنتی بیوتیک های استرپتومایسین و تتراسیکلین و یا ترکیبات مسی استفاده می شود، تعیین حساسیت و یا مقاومت جدایه های عامل بیماری آتشک درختان میوه دانه دار در این پژوهش مورد توجه قرارگرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که هیچکدام از جدایه ها مقاومتی به سولفات مس و آنتی بیوتیک های استرپتو مایسین و تتراسیکلین ندارند. با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی در pcr نیز، ژن های کروموزومی و پلاسمیدی مربوط به مقاو مت در برابر استرپتومایسین در جدایه ها ردیابی نشد که موید حساس بودن جدایه ها در مقابل این آنتی بیوتیک می باشد. در این پژوهش، استفاده از روش های سرلوژیکی، ملکولی و تلفیق آن ها برای ردیابی جمعیت پایین باکتری e. amylovora مورد بررسی قرارگرفت. به این منظور، ابتدا آنتی سرم اختصاصی جدایه a تهیه شد و پس از اطمینان از اختصاصی بودن آن در واکنش با جدایه های e. amylovora در آزمون نشت دو طرفه در آگار، گاماگلوبین اختصاصی آن تهیه گردید. با آزمون الایزای غیرمستقیم معلوم شد که این گاماگلوبین با جدایه های e. amylovora واکنش اختصاصی ایجاد می کند و هیچ گونه اثر متقابلی با باکتری های ساپروفیت یا باکتری های بیمارگر از جنس های دیگر ندارد. استفاده از این گاماگلوبین در آزمون های bio pcr و ic-pcr نشان داد که هر دو روش قادرند جمعیت پایینی از با کتری (در حدود 1-10 واحد تشکیل دهنده پرگنه در میلی لیتر) را ردیابی نمایند که این میزان به روش الایزا در حدود 104 واحد تشکیل دهنده پرگنه در میلی لیتر برآورد شد. با روش bio pcrجمعیت بسیار کم e. amylovora در اختلاط با جمعیت قابل توجهی از باکتری های ساپروفیت در شرایط آزمایشگاهی ردیابی گردید. به روش مزبور، ردیابی e. amylovora در سطح برگ های سیب، 16 روز پس از پاشش باکتری روی برگ، موفقیت آمیز بود. به این ترتیب، روش bio pcrبه عنوان یک روش ساده، قابل اعتماد و حساس برای ردیابی سلول های زنده و فعال e. amylovora معرفی می شود.